1.      ỨNG DỤNG CỦA PROTEOMICS:  nhận dạng (tòan bộ protein trong mẫu, nhận dạng proteins trong mẫu chuyên biệt, những protein có chức năng chuyên biệt ở giai đoạn chuyên biệt của sinh vật, tế bào (biệt hóa, phát triển, phát triển), xác định cách protein tương tác với nhau trong một hệ thông (truyền tín hiệu, sinh tổng hợp, degradation), xác định cách thức và vi trị protein được cải biên. Cải biên giúp điều khiển chức năng protein. Tác dụng hóa chất, dược -> cải biên protein.

2.      Sắc ký - Thành phần trong kỹ thuật sắc ký:Mẫu (sample): cần được lọc trước khi chạy sắc ký. Buffer: lọc nhằm lọai bỏ tạp nhiễm trước khi sử dụng. Pha động (mobile phase):  Dung môi bơm từ reservoir vào cột (column) sắc ký. Nhiều hơn một reserovoir, pha động được bơm vào Mixer (máy trộn) trước khi vào cột. Pha tĩnh (stationary phase): Được giữ lại trong cột bởi môt miếng bông thủy tinh ở đáy cột.Các phân tử sinh học được tách ra tại cột sắc ký. Trong HPLC, Guard column được sử dụng nhằm bảo vệ cột sắc ký.Detector: UV bước sóng 280 nm detect hầu hết protein. UV 205 – 220 detect cả những protein hay peptide ít cấu tử có mạch vòng.

3.      Hệ thống sắc kỷ lỏng cao áp (HPLC):Phase động được bơm vào hệ thông  với tốc độ dòng chảy cao (high flow rate) bởi áp suất cao (55 Mpa). Đường kính các hạt trong pha tĩnh nhỏ, chứa lỗ nhỏ li ti giúp các phân tử sinh học đi vào, và đặc biệt chịu được áp suất cao (các hạt phải rắn hơn các hạt được dùng trong open column chromatography), Việc tách rửa tốt khi tốc độ pha động ổn định. Trong HPLC, pha động thường là hỗn hỡp của hai thanh phần hoặc nhiều hơn -> mixer. Đường ống và cột sắc ký được làm bằng thép không rĩ. Dung môi phải được khử khí và lọc trước khi sử dụng

4.      Sắc ký lọc gel:Phân tử sinh học được giữ trong pha dung môi suốt quá trình sắc ký. Tách lọc các phân tử sinh học dựa trên kích thước và hình dáng, Pha tĩnh gồm các hạt gel chứa nhiều khoảng không nhỏ (xốp). Protein càng nhỏ, càng dễ vào hạt gel và được giữ lâu hơn. Protein tách rửa khỏi cột theo thứ tự khối lượng phân tử giảm dần. Dùng sắc ký lọc gel xác định khối lượng phân tử của protein/enzyme. Kav = (Ve-V0)/(V1-V0) (0 < Kav < 1) với Kav: khối lượng phân tử. Ve: thể tích dung dịch khi enzyme tách khỏi cột. Vt: toàn bộ thể tích cột. Vo: thể tích  khe giữa các hạt gel.

Ứng dụng: Xác định khối lượng phân tử, Loại bỏ các phân tử có kích thước nhỏ không cần thiết. Vd: Loai bỏ muối khỏi dung dịch protein trước khi thực hiện sắc ký trao đổi ion. Tinh sạch protein

5.      Sắc ký trao đổi ion:Protein cạnh tranh thay thế counterion  Na+, Cl−),gắn vào nhóm trao đổi ion (ion Exchanger) trên bề mặt pha tĩnh thông lực hút  tĩnh điện. Sự gắn kết hoàn toàn >trung hòa điện, Điện tích protein do điện tích các mạch Nhánh (R side chain) cấu tử ở môi trường pH nhất định  quyết định. Tại pH acid, hầu hết  Protein tích điện dương và ngược lại

Có 2 loại ion exchanger:Cation exchanger  có khả năng gắn kết ion dương và Anion exchangercó khả năng gắn kết ion âm. Mạch nhánh tích điện gắn vào: cellulose, Agarose, dextran, hay silica (HPLC)

Tách rửa: Gradient nồng độ NaCl và KCl được dùng để tách rửa protein ra khỏi cột sắc ký. Dùng gradient pH của buffer > giảm đđiện tích protein, hoặc trung hòa nhóm  chức năng trên ion exchanger >tương tác của ion exchanger  và protein giảm >tách khỏi cột.

6.      Sắc ký kỵ nước: Các aa ko phân cực: Ala, Val,  leu, Ile, Trp, Met, Phe, Pro.Thường tâp trung tại lõi protein. Có thể tìm thấy trên bề mặt. Protein, Các protein khác nhau có tính kỵ nước bề mặt khác nhau.--à cơ sở của sắc ký kỵ nước.

Tách rửa: Protein được nạp vào cột sắc ký chứa nhóm octyl và phenyl với sự hiện diện 2M (NH4)2SO4.Tách rửa: dùng gradient nồng độ giảm dần (2M – 0) (NH4)2SO4

7.      Sắc ký pha thường: Pha tĩnh: phân cực. Pha động: gradient nông độ dung mội phân cực tăng dần.lúc đầu ko sau dó kem phân cực…Protein phân cực hơn sẽ ra khỏi cột sau và ngược lại.Sắc ký ngược pha: Pha tĩnh: các nhánh hydrocarbon (C-4, C-8, C-18) được gắn lên pha tĩnh. Mẫu được cho vào dung môi phân cực như: nước, methanol, acetronitrile…hoặc hỗn hợp.Proteins sẽ gắn vào pha tĩnh theo tương tác kỵ nước theo các mức độ khạc nhau.

Tách rửa: sử dung gradient nồng độ tăng dần acetonitrile và gradient nồng độ nước giảm dần -> sự tăng dần của tính kỵ nước trong pha động. Prô phân cực ra trước kem phân cực ra sau.

8.      Sắc ký ái lực: Enzyme nhận biết và gắn với cơ chất là một dạng ái lực >lý thuyết xây dựng sắc ký ái lực. Pha tĩnh: Affinity ligand được cố trên pha tĩnh.

9.      Điện di: Trong vùng điện trượng (electric field), phân tử sinh học di chuyển về điện cực trái dấu.Trong vùng điện trường phân tử sinh học di chuyển về điện cực trái dấu. v=E.q/f với v: vận tốc. E: field strength. q: điện tích trên phân tử sinh học. f: hệ số ma sát.

10.  Điện di trên gel:Agarose gel electrophoresis: Tách chiết từ tảo biển, Dùng tách phân tử lớn (DNA, protein >500 Kda), Sau khi đun nóng và làm nguội agarose đông tụ lại nhờ liên kết hydro. Polyacrylamide gel electrophoresis: Dùng tách chiết hầu hết protein và small oligonucleotide (< 2000 bp), Kích thước lỗ có thể kiểm soát được nhờ tỉ lệ polyacrylamide được dùng.

11.  Điện di theo chiều khối lượng: Gel: polyacrylamide, SDS (sodim dodecyl sulfate) : Mạch 12 cacbon kỵ nước và một đầu hiếu nước, gắn chặt protein (1.4g SDS/1g protein) >che phủ phần kỵ nước trên protein -> protein tích điện âm (-).

12.  Điện di theo chiều đẳng điện (IEF): Dưới tác dụng điện trường và trong dãy gradient pH, protein di chuyển và dừng lại tại điểm pI của nó. Gradient pH: hỗn hỡp polyacrylamide (gel) và các ampholyte (đọan polymer ngắn chứa NH2 và COOH) có điểm đẳng điện khác nhau. Ampholyte liên kết cộng hóa trị với polyacrylamide gel. IEF có thể thực hiện: Trong ống thủy tinh (glass tube IEF) (chứa hỗn hợp 2 chất trên).Trên tấm phẳng (Flat – bed IEF) cố định dãy pH.

13.  Điện di 2 chiều: Dùng để: tách chiết protein từ dịch chiết tế bào, mô….Tách chiết protein trước khi thực hiên nhân dạng protein bằng MS. Cùng lúc phân tách hỗn hợp protein phức tạp. 2 DE tách chiết protein dựa trên 2 tính chất riêng biệt của protein qua 2 bước: First dimension: Iso – electric focusing (IEF), giúp phân tách protein dựa trên điểm đẳng điện,  thực hiện IEF gel (IEF strip). Second dimension: SDS PAGE, phân tách protein dựa trên khối lượng phân tử. Mỗi điểm trên 2DE tương ứng với 1 protein trong mẫu phân tích. Một mẫu/gel. Ra đời 1975 do O’ Farrel Klose

Điện di theo chiều thứ nhất thực hiện trên IPG strip (thanh IEF) > Tiến hành IEF >Đặt IEF strip vào bồn điện di để thực hiện điện di theo chiều thứ 2 >Nhuộm và quan sát.

14.  2DE DIGE: Mẫu protein được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau trước khi thực hiện điện di 2 chiều. Có thể thực hiển điện di 3 mẫu trên cùng một gel: internal standard (hỗn hợp của 2 mẫu protein)  và 2 mẫu protein. Các protein cùng loại nhuộm với các chất nhuộm khác nhau sẽ di chuyển đến cùng một vị trí trên gel, Không bị ảnh hưởng bởi gel to gel variations > gia tặng độ chính xác trong định lượng protein.

15.  Khối phổ: khối phổlà một phương pháp phân tích sử dụng mass spectrometor để xác định hợp chất chưa biết, xác định khối lượng của nguyên liệu đã biết, suy ra cấu trúc phân tử, thành phần hóa học của nguyên liệu vô cơ và hữu cơ. Khối phổphân tích ion dạng khí, tất cả phân tử phân tử phân tích phải được chuyển về dạng khí. Hai kỹ thuật tạo ion phổ biến hiện nay: MALDI và ESI. Khối phổ là thiết bị xác định khối lượng phân tử gồm có: bộ phận tạo ion, bộ phận phân tích khối lượng, thiết bị dò, hệ thống kiểm soát

16.  Pp MALDI: là pp tạo ion đc hỗ trợ bởi chất nền.Hỗn hợp mẫu và chất nền được hòa tan trong dung môi  và cho lên đĩa), Dung môi bay hơi để lại tinh thể chất nền trên đĩa. Năng lượng laser được hấp thu bởi tinh thể và phát ra  dưới dạng nhiệt giúp chuyển phận tử protein sang dang ion pha khí. Ion từ MALDI được di chuyển ống dài bằng lực điện trường. Ion nhẹ di chuyển nhanh hơn. Detector  dò và phát hiện ion trong khoảng không. Thời gian bay của ion (TOF) được qui thành khối lượng.Pp ESI:Hỗn hợp ion được tạo thành từ dung dịch mẫu trong điện áp cao. Dung dịch được phun vào hệ thống -> liên kết với HPLC. ESI tạo ra hàng loạt ion ở nhiều mức độ điện tích (multi charge state), Protein, ion dương được phân tích. MALDI – TOF: phân tích protein với 1 hoặc 2 proton. ESI – ION TRAP: Phân tích protein với nhiều proton  

17.  Một số protein sử dụng trong kỹ thuật phân cắt pro trên gel: Protease chuyên biệt cao: Trypsin (C terminal của K và R, không cắt nếu theo sau bởi Pro), Endoproteinase Lys – C, không cắt nếu theo sau bởi Pro, Endoproteinase Asp – N. Protesase chuyên biệt thấp: Chemotrypsin (C terminal của amino acid mạch vòng, không cắt nếu theo sau bởi Pro), Endoproteinase Glu (C terminal của E hay D, không cắt nếu theo sau bởi Pro.

18. Kỹ thuật shotgun: Ý tưởng của phương pháp là nhằm cung cấp thông tin đầy đủ hơn trong việc  xác định protein từ mẫu.Phương pháp còn được gọi là Multi - dimensional protein identification (Mudpit). Mẫu protein phức tạp được phân cắt thành hỗn hợp phức tạp hơn. Phương pháp dựa trên thực tế tất cả các peptides có tính chất vật lý tương tự nhau. (protein thì không). 2 phương pháp sắc ký được dùng: Strong cation exchange (SCX), reverse phase chromatography.

Mudpit: Thuật ngữ Mudpit được áp dụng cho hệ thống sắc ký gồm 2 phase. Mẫu được phân tách trên cột SCX, sau là nanoLC – MS/MS trên cột reverse phase. Mẫu trước khi phân tách cần phải loại bỏ endogenous protease, protease inhibitors.

19. Ms trong xác định cải biên sau dịch mã: Sự cải biện sau dịch mã rất quan trọng đối với chức năng protein. (phosphorylation ở các protein  trong sự truyền tính hiệu liên quan tới các G – proteins, glycosylation ở các thụ thể là protein –receptors…)

20. Ms trong xác định trình tự pro:Phương pháp Edman degradation giúp xác định trực tiếp trình tự protein thay vì thông qua xác định trình tự cDNA (cDNA sequencing)à phương pháp Edman degradation tối ưu hơn vì: Phương pháp thích hợp protein, đoạn peptide ngắn (< 40 cấu tử), Xác định amino acid bằng cách so sánh sự khác biệt về m/z của các peaks kế cận nhau trên bảng phổ. Sự cải biên sau dịch mã cũng được xác định thông qua xác định giá trị m/z của cấu tử cải biên bao gồm khối lượng nhóm cải biên. Edman degradation giúp loại bỏ amino acid ở đầu  N-terminus. à tạo các đoạn cách biệt nhau một amino acid. Các đoạn được phân tích bằng MALDI – TOF.

21. MS trong nghiên cứu tương tác protein: Xác định protein tương tác protein X. Protein X được cố định trên pha tĩnh sepharose. Protein no tương tác với protein X sẽ được giữ lại > SDS page > khối phổ.

22. Protein-biomarker: protein là một biomarker thuận tiện nhất cho việc chẩn đoán bệnh vì làm rõ một số đặc điểm như cải biên sau dịch mã. Protein biomarker có thể được tìm thấy trong dịch cơ thể (body fluid)  như huyết thanh (serum), nước tiểu, dịch xương sống, nước bọt, dịch mắt…Proteomics là công cụ đắc lực giúp xác định biomarker bằng cách so sánh dịch cơ thể của người khỏe mạnh và người bệnh. 1982, 2DGE được sử dụng nhằm phát hiện sự khác biệt về protein của người bệnh và người khỏe mạnh => chưa thể xác định những protein biểu hiện khác biệt, đòi hỏi số lương mẫu lớn và độ nhạy thấp. 1990 MS và sự xuất hiện của protein database giúp xác định protein dễ dàng. 2DGE và MS è phát hiện protein biomarker, bao gồm: biomarker cho các bệnh ung thư, bệnh tim, bệnh thần kinh…

23. Dùng 2 DE so sánh sự khác biệt của các loại thực vật cung loài và khác loài: Khảo sát quá trình sinh lý trong thực vật à phát hiện protein  phù hợp trong sản xuất nông nghiệp. So sánh thực vật khỏe mạnh và nhiễm bệnh, hoặc so sánh thực vật trang thái ổn đinh và stress. Proteomics phân tích  lá, rễ, hạt lúa sử dụng 2DGE và Mudpit  2500 protein được phát hiện, có sự khác biệt biểu hiện gene ở 3 mô  phát hiện các tác nhân gây dị ứng trong nôi nhũ hạt. Phát hiện chức năng protein.

24. Proteomics trong phân tích thực vật chuyển đổi gen: Thực vật chuyển đổi gen (genetically modified plant – GM plant), Cây trồng được sử dung như bioreactor giúp sản suất protein và các chất khác à GM plant phẩm chất tốt hơn, Dư luận lo lắng về độ an tòan của GM  đòi hỏi phải có sự phân tích khoa học kỹ càng trước khi đưa GM food ra thị trường, Dùng proteomics phân tích so sánh thực vật chuyển gen và không chuyển gen: chất dinh dưỡng, các chất của quá trình sinh tổng hợp, độc tố…Proteomics quan trọng trong đánh giá độ an toàn của GM food vì khả năng phân tích sự cải biên sau dịch mã.

25. Proteomics trong phân tích secondary metabolism:Secondary metabolites (các chất chuyển hóa thứ cấp): hàm lượng thấp, không thuộc quá trình chuyển hóa chính, có chức năng sinh học quan trọng. Chúng được sử dụng như dược liệu, chất nhuộm, chất tạo hương, mùi vị…Proteomics có thể phân tích enzyme, protein điều hòa, protein vận chuyển…tham gia trong quá trình trao đổi chất thứ cấp. VD: Madagascar periwinkle (Catharanthus roseus) có khả năng sản xuất hành trăm lọai alkaloids bào gồm các chất chống ung thư như vinblastine và vincristine . Proteomics phân tích cho thấy năm protein có liên quan đến sự sản sinh alkaloids.

26. ICATS  là những chất phản ứng với cystein của protein biến tính.Có 2 dạng: dạng thường – dạng nhẹ (light form - normal form) và dạng nặng (heavy form, Hydrogen được thay thế bằng deuterium – heavy hydrogen 2H ). ICATS gồm 3 thành phần: reactive group (vd: thiol), a linker group (tồn tại dạng đồng phân nặng và nhẹ), affinity handle (vd: biotin). Mẫu protein 1 được đánh dấu bằng ICATs ở  dạng nhẹ. Mẫu protein 2 được đánh dấu bằng ICATs ở dạng nặng. Hai mẫu trên được trộn và digest tạo peptide. Hỗn hợp peptide được phân tách và phân tích định lượng thông qua LC-MS/MS. Tra cứu cơ sở dữ liệu à xác định protein.  Không thể phân tích định lượng protein không chứa cystein trong thành phần cấu tạo.

27. Đánh dấu peptid: Trypsin cắt protein tạo peptide với một đầu C – terminus mới à tạo điều kiện oxygen từ nước gắn vào nhóm carboxyl của peptide. Protein từ 2 nguồn khác nhau được digest bằng trypsin trong dung dịch buffer  có chứa nước có O16 và O18.

28. Gắn thẻ đồng vị: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường chứa đồng vị phóng xạ nặng hay nhẹ của hydrogen, carbon, nitrogen…Đánh dấu amino acid: stable – isotope labeling with amino acid  in cell culture(SILAC). Thu nhận tế bào, kết hợp, tách protein,  tryptic digestion ,  phân tích bằng phổ MS. Sự đánh dấu protein từ giai đoạn đầu à loại bỏ sự biến đổi từ khâu chuẩn bị và tinh sạch mẫu. Chỉ áp dùng cho phân tích protein trong tế bào sống.

29. MCAT: Chất hóa học có khối lượng xác định được dùng đánh dấu protein.Mẫu protein 1 được  đánh dấu bằng O- methylisourea và mẫu protein 2 không được đánh dấu. Phương pháp đơn giản, ít tốn kém, nhưng kém chính xác so với phương pháp đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ.